PRÁCTICA 12: IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNASPOR INMUNOELECTROFORESIS.

• OBJETIVO:

Separar las proteínas contenidas en un suro e identificar en él la posible presencia de albúmina e Ig G.

• APARATAJE:

-Alimentador de electroforesis.

• COMPONENTES DEL KIT:

A: Ig G
B: Suro sanguíno.
C: Albúmina.
D: Ac frente al suero.
E: Ac frente a la Ig G.
F: Polvo de agarosa.
G: Tampón de electroforesis concentrado.
-Papel de filtro.
-Pajitass para perforar los pocillos.
-Placas de petri.

• PROCEDIMIENTO:

 PREPARACIÓN DEL TAMPÓN Y EL GEL DE ELECTROFORESIS:

TAMPÓN:
 Dilución de 40 mL del bote que lo contiene en forma concentrada en 960 mL de agua destilada.
GEL DE AGAROSA PARA ELECTROFORESIS:
1º. Disolver la agarosa en 200 ml del tampón de electroforesis.
2º. Calentar la mezcla en el microondas hasta disolver completamete el polvo de agarosa.
3º. Enfriar la solución hasta 60ºC en el baño termostático.
4º. Construir un molde para los carriles utilizando una placa de petri pequeña con cuatro portaobjetos.
5º. Pipetear la cantidad necesaria de gel de agarosa n la bandeja de la cubeta de electroforesis procurando cubrir el fondo uniformemente sin burbujas. Antes de qu solidifique, introducir el molde para los carriles.
6º. Cuando el gel haya solidificado, extraer el mold para los carriles y guardar el gel en cámara húmeda hasta el momento de su uso.

REALIZACIÓN ELECTROFORESIS:

1º. Realizar los pocillos en el gel con ayuda de la pajita.
2º. Colocar la bandeja con el gel en la cubeta de electroforesis y colocar el papel de filtro(empapado con tampón) de manera que sobresalga hacia el exterior.
3º. Vertir el tampón en cada uno de los vasos de la cubeta de electroforesis(asegurarse de que éste sumerge en el tampón).
4º. Dispensar 20 μL de cada Ag (A,B,C) en los pocillos correspondientes.
5º. Cerrar la tapa de la cubeta de elctroforesis y conectar los electrodos respetando la polaridad.
6º. Conectar la cubeta a la fuente de alimentación y aplicar un voltaje de 125v durante 30-35'.
7º. Una vez finalizada la electroforesis, desconectar la fuente de alimentación y quitar la tapa de la cubeta.Retirar el papel de filtro y extraer de la cubeta la bandeja con el gel. Deposítalo sobre una superficie horizontal para proceder a la fase de difusión Ag-Ac.

DIFUSIÓN DE LOS AG Y AC:

1º. Añadir 60 μL de cada Ac en el carril correspondiente. Dispensar el Ac procurando que se distribuya por todo el carril.
2º. Colocar la bandeja con el gel n una cámara húmeda.
3º. Tras 24-48 h serán visibles los arcos de precipitación en el gel.

• RESULTADOS:

La lectura no se puede realizar porque no se perciben los arcos de precipitación en el gel.

• FOTOGRAFÍAS:

PRÁCTICA 11: EXTRACCIÓN "CASERA" DE ADN.

• OBJETIVO:

Extracción de ADN  de una muestra vegetal.

• FUNDAMENTO:

La extración de ADN de una muestra celular se basa n l hecho de que los iones salinos son atraídos hacia las cargas  negativas del ADN, permitiendo su disolución y posteriore extracción de la célula.

• APARATAJE:

-Batidora.
-Nevera.

• MATERIAL:

-Muestra vegetal.
-Agua destilada.
-Sal de mesa.
-Bicarbonato sódico.
-Detergente líquido.
-Alcohol etílico frío.
-Colador.
-Vaso.
-Tubo de ensayo.
-Varilla.

• PROCEDIMIENTO:

1º. Preparar el tampón con los siguientes ingredientes.
- 120 ml de agua destilada.
-1,5 g de sal de mesa.
-5 g de bicarbonato sódico.
-5 ml de detergente líquido.
2º. Cortar y triturar la muestra vgetal.
3º. Mezclar en un recipiente limpio 5 ml del triturado celular con 10 ml del tampón frío y agitar durante 2'.Separar los restos d vegetales más grandes del caldo molecular haciéndolo pasar por un colador.
4º. Retirar 5 ml del caldo molecular a un tubo de ensayo y añadir con pipeta 10 ml de alcohol frío.
5º. Introducir la punta de una varilla hacia delante y hacia atrás y poco a poco se irán enrrollando los fragmentos de mayor tamaño de ADN. Pasado 1' retirar la varilla atravesando la capa de alcohol con lo cual el ADN quedará adherido a su extrmo con el aspecto de un copo de algodón mojado.

• RESULTADO:

• FOTOGRAFÍAS:

PRÁCTICA 10: ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS PLASMÁTICAS.

• OBJETIVO:

Separación de las cinco fracciones correspondientes a las diferentes proteínas plasmáticas:
-Albúmina.
-α1-globulinas.
-α2-globulinas.
-β-globulinas.
-γ-globulinas.

• FUNDAMENTO:

Las proteínas,moléculas anfóteras, en medio básico adquieren una carga global negativa que hace que migren del cátodo hacia el ánodo cuando son sometidas a un proceso electroforético.

APARATAJE:

-Alimentador para electroforesis.

• MATERIAL:

- Cubeta de elctroforesis.
- Aplicador automático.
- Tiras de acteato de celulosa.
- Láminas Mylar.
- Papel de filtro.

• REACTIVOS.

- Solución tampón (Tris hipurato).
- Colorante rojo Ponceau.
- Decolorante rojo Ponceau (ácido cítrico).
- Solución transparentadora.
- Solución disolvente (ácido acético al 80%).

• PROCEDIMIENTO:

1º. Preparación del buffer -> 100 ml de Tris hipurato concentrado para 1000 mL de agua destilada.
2º. Preparación del decolorante -> disolver decolorante rojo Ponceau en 1000 mL de agua destilada.
3º. Equilibrado de las tiras -> introducir las tiras en 100 mL de buffer.
4º. Preparación cámara de electroforesis -> llenar la cámara de electroforesis.
5º. Selección de la muestra -> suero.
6º. Secado de las tiras -> quitar exceso de buffer con dos hojas de filtro.
7º. Colocación de las tiras en el puente -> colocar las tiras en el puente(cara absorbente hacia arriba). Colocar el puente en la cámara de electroforesis. Aplicar la muestra((hacerse a unos 2 cm del borde situado más cerca del polo negativo) en la tira con ayuda del aplicador. Tapar la cámara de electroforesis.
8º. Tiempo y voltaje -> conectar fuente de alimentación 220v durante 35'. Desconectar la fuente y extraer las tiras.
9º. Tinción de la tura -> semergir las tiras 5' en colorante Ponceau.
10º. Decoloración de la tira -> sumergir las tiras en solución de ácido cítrico(hasta obtener un fondo blanco).
11º. Transparentado -> sumergir las tiras en el líquido transparentador 1'. Colocar la tira sobre la superficie d una lámina Mylar, cortar los bordes sobrantes y liminar el exceso de tampón. Calentar la tira 80ºC en la estufa 10' . Sacar la tira de la estufa y esperar a que se enfríe para realizar la lectura.
12º. Lectura en  fotodensitómetro -> introducir la tira en un fotodensitómetro y proceder al trazado del proteinograma y a su cuantificación por fracciones.

• RESULTADOS:

- Albúmina = 50%
- α1-globulinas.
-α2-globulinas.
-β-globulinas.
-γ-globulinas.

DATOS OBTENIDOS CON EL FOTODNSITÓMETRO:
ÁREA TOTAL = 335
Pico 1 (Albúmina) = 135

335 -> 100
135 -> x
x= 40,29 % albúmina.

OBSERVACIONES:

Resultados incompletos.

• FOTOGRAFÍAS: