PRÁCTICA 10: ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS PLASMÁTICAS.

• OBJETIVO:

Separación de las cinco fracciones correspondientes a las diferentes proteínas plasmáticas:
-Albúmina.
-α1-globulinas.
-α2-globulinas.
-β-globulinas.
-γ-globulinas.

• FUNDAMENTO:

Las proteínas,moléculas anfóteras, en medio básico adquieren una carga global negativa que hace que migren del cátodo hacia el ánodo cuando son sometidas a un proceso electroforético.

APARATAJE:

-Alimentador para electroforesis.

• MATERIAL:

- Cubeta de elctroforesis.
- Aplicador automático.
- Tiras de acteato de celulosa.
- Láminas Mylar.
- Papel de filtro.

• REACTIVOS.

- Solución tampón (Tris hipurato).
- Colorante rojo Ponceau.
- Decolorante rojo Ponceau (ácido cítrico).
- Solución transparentadora.
- Solución disolvente (ácido acético al 80%).

• PROCEDIMIENTO:

1º. Preparación del buffer -> 100 ml de Tris hipurato concentrado para 1000 mL de agua destilada.
2º. Preparación del decolorante -> disolver decolorante rojo Ponceau en 1000 mL de agua destilada.
3º. Equilibrado de las tiras -> introducir las tiras en 100 mL de buffer.
4º. Preparación cámara de electroforesis -> llenar la cámara de electroforesis.
5º. Selección de la muestra -> suero.
6º. Secado de las tiras -> quitar exceso de buffer con dos hojas de filtro.
7º. Colocación de las tiras en el puente -> colocar las tiras en el puente(cara absorbente hacia arriba). Colocar el puente en la cámara de electroforesis. Aplicar la muestra((hacerse a unos 2 cm del borde situado más cerca del polo negativo) en la tira con ayuda del aplicador. Tapar la cámara de electroforesis.
8º. Tiempo y voltaje -> conectar fuente de alimentación 220v durante 35'. Desconectar la fuente y extraer las tiras.
9º. Tinción de la tura -> semergir las tiras 5' en colorante Ponceau.
10º. Decoloración de la tira -> sumergir las tiras en solución de ácido cítrico(hasta obtener un fondo blanco).
11º. Transparentado -> sumergir las tiras en el líquido transparentador 1'. Colocar la tira sobre la superficie d una lámina Mylar, cortar los bordes sobrantes y liminar el exceso de tampón. Calentar la tira 80ºC en la estufa 10' . Sacar la tira de la estufa y esperar a que se enfríe para realizar la lectura.
12º. Lectura en  fotodensitómetro -> introducir la tira en un fotodensitómetro y proceder al trazado del proteinograma y a su cuantificación por fracciones.

• RESULTADOS:

- Albúmina = 50%
- α1-globulinas.
-α2-globulinas.
-β-globulinas.
-γ-globulinas.

DATOS OBTENIDOS CON EL FOTODNSITÓMETRO:
ÁREA TOTAL = 335
Pico 1 (Albúmina) = 135

335 -> 100
135 -> x
x= 40,29 % albúmina.

OBSERVACIONES:

Resultados incompletos.

• FOTOGRAFÍAS: