BIOQUÍMICA

PRÁCTICA 12: IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNASPOR INMUNOELECTROFORESIS.

OBJETIVO:

Separar las proteínas contenidas en un suro e identificar en él la posible presencia de albúmina e Ig G.

APARATAJE:

-Alimentador de electroforesis.

COMPONENTES DEL KIT:

A: Ig G
B: Suro sanguíno.
C: Albúmina.
D: Ac frente al suero.
E: Ac frente a la Ig G.
F: Polvo de agarosa.
G: Tampón de electroforesis concentrado.
-Papel de filtro.
-Pajitass para perforar los pocillos.
-Placas de petri.

PROCEDIMIENTO:

PREPARACIÓN DEL TAMPÓN Y EL GEL DE ELECTROFORESIS:

TAMPÓN:
Dilución de 40 mL del bote que lo contiene en forma concentrada en 960 mL de agua destilada.
GEL DE AGAROSA PARA ELECTROFORESIS:
1º. Disolver la agarosa en 200 ml del tampón de electroforesis.
2º. Calentar la mezcla en el microondas hasta disolver completamete el polvo de agarosa.
3º. Enfriar la solución hasta 60ºC en el baño termostático.
4º. Construir un molde para los carriles utilizando una placa de petri pequeña con cuatro portaobjetos.
5º. Pipetear la cantidad necesaria de gel de agarosa n la bandeja de la cubeta de electroforesis procurando cubrir el fondo uniformemente sin burbujas. Antes de qu solidifique, introducir el molde para los carriles.
6º. Cuando el gel haya solidificado, extraer el mold para los carriles y guardar el gel en cámara húmeda hasta el momento de su uso.

REALIZACIÓN ELECTROFORESIS:

1º. Realizar los pocillos en el gel con ayuda de la pajita.
2º. Colocar la bandeja con el gel en la cubeta de electroforesis y colocar el papel de filtro(empapado con tampón) de manera que sobresalga hacia el exterior.
3º. Vertir el tampón en cada uno de los vasos de la cubeta de electroforesis(asegurarse de que éste sumerge en el tampón).
4º. Dispensar 20 μL de cada Ag (A,B,C) en los pocillos correspondientes.
5º. Cerrar la tapa de la cubeta de elctroforesis y conectar los electrodos respetando la polaridad.
6º. Conectar la cubeta a la fuente de alimentación y aplicar un voltaje de 125v durante 30-35'.
7º. Una vez finalizada la electroforesis, desconectar la fuente de alimentación y quitar la tapa de la cubeta.Retirar el papel de filtro y extraer de la cubeta la bandeja con el gel. Deposítalo sobre una superficie horizontal para proceder a la fase de difusión Ag-Ac.

DIFUSIÓN DE LOS AG Y AC:

1º. Añadir 60 μL de cada Ac en el carril correspondiente. Dispensar el Ac procurando que se distribuya por todo el carril.
2º. Colocar la bandeja con el gel n una cámara húmeda.
3º. Tras 24-48 h serán visibles los arcos de precipitación en el gel.