PRÁCTICA 13: DETERMINACIÓN DEL FACTOR Rh POR PCR.
Detrminación del Rh utilizando para ello las tácnicas de la PCR y de la electroforesis de ADN. Para ello aislaremos el ADN de la salida y lo utilizaremso para llevar acabo la reacción de PCR.
La base de esta práctica es la amplificación de un fragmento del gen D. La amplificación de este fragmento indicará que la persona es Rh +. Debido a que los genes D y CE son altamente homólogos, es posible diseñar cebadores que se emparejaran en una región del gen D y también en una región del gen CE. De esta forma, los individuos Rh produciran 2 fragmentos de diferentes tamaños correspondientes a los gnes D y CE, mientras que los individuos Rh - producirán un único fragmento correspondiente al gen CE.
EXTRACCIÓN DEL ADN:
APARATAJE:
- Microcentrífuga con capacidad para 13000-16000 rpm.
- Vórtex.
- Baño termostático a 37ºC.
- Micropipetas y puntas.
MATERIALES:
- Tubos de centrífuga de 15 ml.
- Tubos de microcentrífuga de 1'5 ml.
- Microcentrífuga con capacida.
REACTIVOS:
- R de lisis celular.
- R precipitante de proteínas.
- R hidratante para el ADN.
- Isopropanol.
- Etanol al 70 %
- SSF NaCl al 0,9%
PROCEDIMIENTO:
EXTRACCIÓN DEL ADN:
Lisis celular:
Dispensar 10 ml de SSF en un tubo de 15 mL.
Poner la SSF en el interior de la boca y enjuagar enérgicamente durante 10-20''.
Devolver la SSF al tubo de 15 mL y centrifugarlo a 1500-2000 rpm durante 10 ''.
Eliminar el sobrenadante poniendo especial cuidado de no resuspender el pellet celular del fondo del tubo.
Añadir 600 μl del R de lisis celular y mezclar hasta resuspender las células.
Transferir el contenido anterior a un tubo limpio de 1,5 mL.
Incubar a 37ºC durante 10'. Agitar el tubo suavemente por inversión cada 2'.
Precipitación de proteínas:
Añadir 200 μl del R precipitante de proteínas al tubo de muestra.
Llevar al vórtex y agitar a alta velocidad 20-30'' para mezclar uniformemente el precipitante de proteínas con las células lisadas.
Centrifugar a 13000-16000 rpm durante 5'. Las proteínas precipitadas formarán un denso pellet en el fondo del tubo. Repertir los dos pasos anteriores, precedidos de una incubación en hielo durante 5', si dicho pellet no es visible y volver a centrifugar.
Precipitación del ADN:
Verer el sobrenadante que contiene el ADN, sin remover el pellet de proteínas , en un tubo de 1,5 mL con 600 μl de isopropanol.
Mezclar suavemente por inversión del tubo unas 40-50 veces.
Centrifugar a 13000-16000 rpm durante 2'. El ADN debería ser invisible como un pequeño pellet de color blanquecino en el fondo del tubo.
Descartar el sobrenadante e invertir el tubo sobre papel absorbante limpio para eliminar restos de líquido.
Añadir 600 μl de etanol al 70% e invertir el tubo varias veces , hasta disolver el pellet de ADN.
Centrofugar a 13000-16000 rpm durante 1'.
Con cuidado eliminar el etanol. El pellet puede estar suelto, se debe estar atento para evitar su pérdida.
Invertir el tubo sobre papel absorvente limpio para eliminar restor de líquido y dejar secar al aire durante 5-10'.
Hidratación del ADN:
Añadir 250-300 μl de R hidratante para el ADN y resuspender el pellet mediante pipeteo arriba y abajo.
Almacenar el ADN hidratado en el refrigerador.
AMPLIFICACIÓN POR PCR:
APARATAJE:
- Termociclador.
MATERIALES:
- Tubos de 0,2 mL.
- Micropipetas y puntas.
REACTIVOS:
- Mix PCR
- Control +
- Agua destilada.
PROCEDIMIENTO:
Marcar un tubo de 0,2 mL como 'C+', otro como 'C-' y 'M5'.
Dispensar las siguientes cantidades:
- 'C-' -> 22,5 μl de mix PCR y 2'5 μl de agua destilada.
-'C+' -> 22'5 μl de mix PCR y 2'5μl de control positivo.
- 'M' -> 22'5 μl de mix PCR y 2'5μl del ADN.
Pasar los tubos al termociclador programado con los siguientes valores:
- 10' a 95ºC.
- 35 ciclos:
- 1' a 95ºC
- 1' a 64ºC
- 1' a 72ºC
-10' A 72ºC
ELECTROFORESIS E INTERPRETACIÓN:
APARATAJE:
- Fuente de alimentación.
-Transiluminador.
- Sistema de captación de geles.
- Microondas.
MATERIALES:
- Cubeta de electroforesis.
- Tubos de 0,2 mL.
- Recipientes de vidrio adeciados.
- Micropipetas y puntas.
REACTIVOS:
- Tampón TBE.
- Agarosa.
- Colorante SYBR-GREEN.
- Marcador de Pm(escalera de ADN).
- Tampón de carga.
PROCEDIMIENTO:
Preparación del gel de agarosa:
Preparar la solución de agarosa al 2%(polvo de agarosa en tampón TBE).
Introducir en el microondas y calentar hasta ebullición. Seguidamente mantener en un baño termostático a 65ºC.
Añadir 7 u 8 μl de colorante SYBR-GREEN por cada 100 mL de solución de agarosa y mezclar bien.
Verter la solución de agarosa al 2% en un molde de la cubeta de electroforesis debidamente preparado( y con un peine para los pocillos colocado), hasta alcanzar un espesor de unos 8 mm. Dejar solidificar.
Retirar el peine y los topes de sellado laterales.
Carga de las muestras, controles y marcador de pm:
Marcar un tubo de 0,2 mL como 'Pm' y poner en él 12 μl de marcador de Pm , posteriormente añadirle 3 μl de tampón de carga. Mezclar bien y cargar en el primer pocillo de la placa de agarosa.
Usar una micripopeta con una punta nueva para cargar el contenido de cada tubo 'M','C+' Y 'C-' en los pocillos asignados del gel de agarosa al 2% .
Conectar la fuente de alimentación a 120-130 voltios durante 30-40'. La separación de carga será adecuada cuando el colorante de carga se haya movido 5-10 cm desde los pocillos.
Interpretación de resualtados:
Tras desconectar la fuente de alimentación y extraer y escurrir el gel de agarosa, colocarlo en el transiluminador , taparlo con el cono del sistema de captación y encender ambos aparatos.
Enfocar las bandas de ADN y
proceder a fotografiarlas.
- RESULTADOS:
De las cuatro muestras la situada en el pocillo nº 6 es Rh - (produce un único gragmente correspondiente al gen CE), las tres restantes son Rh + (produce dos fragmentos de diferentes tamaños correspondientes a los genes D y CE).
Las cuatro muestras son RH +(produce dos fragmentos de diferentes tamaños correspondientes a los genes D y CE).
EXTRACCIÓN DEL ADN
AMPLIFICACIÓN POR PCR:
ELECTROFORESIS E INTERPRETACIÓN:
Enlace vídeo procedimiento determinación del factor Rh por PCR realizado por la compañera Noemí Sánchez Contreras:
https://www.youtube.com/watch?v=TdLrgWic8gE
