BIOQUÍMICA

PRÁCTICA 9: PRÁCTICA DE E.L.I.S.A. INMUNODOTING

OBJETIVO:

Detección de la presencia o ausencia de IgGs bovinas en varias muestras problema de suero mediante un ensayo de inmunodot.

UTILIDAD CLÍNICA:

Se usa para la medida de inmunoglobulinas, proteínas oncofecales y hormonas como la insulina, estrógenos y gonadotropina coriónica humana (test de embarazo). También para la detección de agentes que causan enfermedades infecciosas(toxinas bacterianas, retrovirus o virus de la hepatitis B).

FUNDAMENTO:

Etapas ensayo inmunoenzimático. Previamente al comienzo de éste, ha habido que fijar el primer Ac al soporte o pocillo (i) y marcar el segundo Ac con la enzima(ii). El análisis consta de tres etapas: (a) incubación de la muestra con el primer Ac, (b) incubación con el segundo Ac y (c) desarrollo del color mediante una reacción enzimática.

MATERIALES:

- Placa de análisis.
- Agua destilada.
- Gradilla.
- Micropipeta(5 µl).
- Puntas de pipeta.
- Vaso de precipitado.
- Pipeta pasteur.
- Cubeta.

REACTIVOS:

- Control +
- Control -
- Muestras de suero sanguíneo M1,M2 y M3).
- Sustrato.
- Cromógeno.
- Solución bloqueo (ovoalbúmina).

PROCEDIMIENTO:

PREPARACIÓN DE LA PLACA DE ANÁLISIS DE NITROCELULOSA:
- En primer lugar colocamos en el centro de cada ventanilla 5 µl de la muestras y los controles y dejar que se seque hasta que desaparezca la mancha.
- Seguidamente las cubrimos con solución de bloqueo durante 30', retiramos dicha disolución y lavamos con abundante agua destilada.
DESARROLLO DE LA PRUEBA:
- Sacudimos bien la placa para que no quede agua acumulada en los bordes interiores de las ventanas y secamos el borde de plástico alrededor de cada ventana.
- A continuación añadimos en cada pocillo el conjugado e incubamos 10' a temperatura ambiente, transcurrido dicho tiempo lavamos con agua destilada , sacudimos la placa y añadimos el cromógeno dejando desarrollar el color moviendo ligeramente la solución, cuando la señal del control positivo sea clara lavamos con agua destilada y dejamos que la placa seque completamente para visualizar los resultados con mayor facilidad.