PRÁCTICA 9: PRÁCTICA DE E.L.I.S.A. INMUNODOTING

• OBJETIVO:

Detección de la presencia o ausencia de IgGs bovinas en varias muestras problema de suero mediante  un ensayo de inmunodot.

• UTILIDAD CLÍNICA:

Se usa para la medida de inmunoglobulinas, proteínas oncofecales y hormonas como la insulina, estrógenos y gonadotropina coriónica humana (test de embarazo). También para la detección de agentes que causan enfermedades infecciosas(toxinas bacterianas, retrovirus o virus de la hepatitis B).

• FUNDAMENTO:

Etapas ensayo inmunoenzimático. Previamente al comienzo de éste, ha habido que fijar el primer Ac al soporte o pocillo (i) y marcar el segundo Ac con la enzima(ii). El análisis consta de tres etapas: (a) incubación de la muestra con el primer Ac, (b) incubación con el segundo Ac y (c) desarrollo del color mediante una reacción enzimática.

• MATERIALES:

- Placa de análisis.
- Agua destilada.
- Gradilla.
- Micropipeta(5 µl).
- Puntas de pipeta.
- Vaso de precipitado. 
- Pipeta pasteur.
- Cubeta.

• REACTIVOS:

- Control +
- Control -
- Muestras de suero sanguíneo M1,M2 y M3).
- Sustrato.
- Cromógeno.
- Solución bloqueo (ovoalbúmina).

• PROCEDIMIENTO:

PREPARACIÓN DE LA PLACA DE ANÁLISIS DE NITROCELULOSA:
 - En primer lugar colocamos en el centro de cada ventanilla 5 µl de la muestras y los controles y dejar que se seque hasta que desaparezca la mancha.
- Seguidamente las cubrimos con solución de bloqueo durante 30', retiramos dicha disolución y lavamos con abundante agua destilada.
DESARROLLO DE LA PRUEBA: 
- Sacudimos bien la placa para que no quede agua acumulada en los bordes interiores de las ventanas y secamos el borde de plástico alrededor de cada ventana.
- A continuación añadimos en cada pocillo el conjugado e incubamos 10' a temperatura ambiente, transcurrido dicho tiempo lavamos con agua destilada , sacudimos la placa y añadimos el cromógeno dejando desarrollar el color moviendo ligeramente la solución, cuando la señal del control positivo sea clara lavamos con agua destilada y dejamos que la placa seque completamente para visualizar los resultados con mayor facilidad.

• RESULTADO:

La muestras 1 y 3 contien IgGs bovinas porque podemos observar el color morado que indica el correcto desarrollo de la reacción.

• FOTOGRAFÍAS:

 

PRÁCTICA 8: PRÁCTICA DE INMUNODIFUSIÓN RADIAL (MANCINI).

• OBETIVOS:

Cuantificar por inmunodifurión radial la [ ] de inmunoglobulinas en el suero sanguíneo bovino.

• FUNDAMENTOS:

El antisuero es el suero sanguíneo sanguíneo que contiene Ac contra el antígeno que se quiere medir. El Ag difunde a través del gel y se combina con el antisuero hasta alcanzar la zona de equivalencia. En este punto aparecen precipitados Ag-Ac en forma de císculo concéntrico alrededor del pocillo. El diámetro del cículo formado es proporcional a la  [ ] de Ag.

• APARATAJE:

- Contador de colonias.

• MATERIALES:

- Placas de petri(soporte del gel de agarosa).
- Micropipeta (10 µl).
- Punta de pipeta.
- Pipetas pateur.
- Cámara húmeda: placa de petri con un poco de algodón humedecido con agua destilada.
- Papel de filtro

• REACTIVOS:

- Disolución de lavado.
- Disolución colorante.
- Disolución decolorante.
- Patrones de IgG ( 0,05  0,1  0,2  0,4 mg/ml) y muestra problema (suero sanguíneo).

• PROCEDIMIENTO:

- En primer lugar aplicamos las muestras patrones y problemas de forma ordenada en los pocillos (10 µl).
- Seguidamente introducimos la placa de petri en la cámara húmeda y dejamos difundir a temperatura ambiente hasta que los precipitados puedan observarse a trasluz.
- A continuación retiramos la placa de la cámara húmeda y realizamos dos lavados cubriendo la placa entera con ayuda de una pipeta pasteur, recortamos varios papeles de filtro del mismo tamaño que el del gel y humedecemos con agua destilada el que queda en contacto directo con la agarosa, cerramos la placa y le colocamos peso encima durante 10' para que el gel quede reducido a una película húmeda de 1-2 mm que finalmente se terminará de secar en la estufa a 37º durante 10'.
- Una vez que el gel esté completamente seco y transparente la cubrimos con colorante ,una vez teñido, añadimos el decolorante (3-4') y agitamos suavemente.La disolución se debe cambiar unas 3-4 veces haste que el fondo de la placa haya quedado claro, finalmenye secamos en estufa.

• RESULTADOS:

Para calcular la [ ] de la muestra problema mediremos el diámetro de los aros con ayuda del contador de colonias y realizamos una curva de calibración como la que se muestra a continuación y a partir de la cual obtendremos dicha  [ ]

Diámetro muestra -> 5 mm
[ ] muestra -> 0,07 mg/ml

• FOTOGRAFÍAS:

 


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PRÁCTICA 7: HEMOGLOBINA A1C.CROMATOGRÁFICA-ESPECTOFOTOMÉTRICA.

OBJETIVOS:

Concentración de HbA1C en una muestra.

FUNDAMENTOS:

Después de preparar un hemolizado, donde se elimina la fracción lábil, las hemoglobinas son retenidas por una resina de intercambio catiónico.. La hemoglobina HbA1C se eluye de forma específica, previa eliminación por lavado de la HbA1a+b, y se cuantifica por lectura fotométrica a 415 nm. La estimación de la [ ] relativa de HbA1C se realiza frente a la [ ]  de Hb total, determinada también por lectura fotométrica a 415 nm.

APARATAJE.

Fotómetro. Utilidad:
Instrumento utilizado para las medidas de absorción de REM(radiación electromagnética).

 MATERIALES:

- Tubos de ensayo.
- Gradilla.
- Micropipeta (50µl , 200µl y 400µl).
- Puntas de pipeta.
- Papel parafina.
- Gradilla de espectofotómetro.
- Cubetas de espectofotómetro.

REACTIVOS:

- R1
- R2
- R3
- Microcolumna.
- Sangre.

PROCEDIMIENTO:

-Primeramente preparamos el hemolizado añadiendo 50µl de sangre y 200µl de R1,tapamos con papel parafina, agitamos y dejamos a temperatura ambiente 10-15'.

-Seguidamente destapamos la microcolumna, rompemos la lengueta inferior y bajamos el disco superior hasta llegar al nivel de la resina con ayuda de una pipeta y dejamos gotear hasta que el líquido alcance el nivel del disco , desechandolo.

-A continuación aplicamos sobre el disco superior 50µl de hemolizado y desechamos el eluido.
Una vez que haya penetrado todo el hemolizado, añadimos 200µl de rectivo y volvemos a desechar el eluidoy para finalizar añadimos 2000µl de R2 y desechamos

-Por último, colocamos la microcolumna sobre otro tubo de ensayo y añadimos 400µl  de R3 y recogemos el eluido, tapamos con papel parafina y homogeneizamos.

-Por otro lado, pipeteamos en un tubo de ensayo 12,0ml de agua destilada y 50µl de hemolizado, tapamos con papel parafina y homogeneizamos.

-Traspasamos el contenido de ambos tubos a las cubetas de espectofotómetro donde leeremos la absorvancia a 415 nm frente a agua destilada.

RESULTADOS:

Absorbancias:
-Hb total= 0,585 nm.
-Hb A1C= 0,213 nm.
Cálculo:
A HbA1C/A Hb total x 100/3 = 12,24% HbA1C.

OBSERVACIONES:

Los resultados obtenidos no son correctos debido a las malas condiciones de la muestra(sangre).

FOTOGRAFÍAS:

PRÁCTICA 6: PROTEÍNAS TOTALES. REFRACTOMETRÍA Y MÉTODO DE BIURET.


MÉTODO DE BIURET :

• OBJETIVOS:

Determinación cuantitativa de proteínas totales. 

• UTILIDAD CLÍNICA:

Las proteínas son compuestos orgánicos macromoleculares, ampliamente distribuidos en el organismo. Actúan como elementos estructurales y de transporte . Se dividen en dos fracciones, albúmina y globulinas.
Su determinación es útil para la detección de:
- Hiperproteinemia producida por hemoconcentración, deshidratación o aumento en la concentración de proteínas específicas.
-  Hipoproteinemia por hemodilución debida a un defecto en la síntesis proteica, pérdidas excesivas (hemorragias) o catabolismo proteico excesivo.

• FUNDAMENTOS:

En medio alcalino, las proteínas dan un intenso color violeta azulado en presencia de sales de cobre: contiene yoduro como antioxidante .
La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de proteína total en la muestra ensayada.

• APARATAJE:

Espectofotómetro.
Utilidad:
Instrumento utilizado para las medidas de absorción de REM(radiación electromagnética).

• MATERIALES:

- Micropipetas (25µl y 1000µl).
- Puntas de micropipeta.
- Tubos de ensayo(3)
- Gradilla.

• REACTIVOS:

- R
- Patrón.
- Muestra(suero).

• PROCEDIMIENTO:

 -En primer lugar pipeteamos en los diferentes tubos de ensayo las cantidades siguientes:

1.  BLANCO ->  1000 µl de R
2. PATRÓN -> 1000 µl de R y 25 µl patrón
3.  MUESTRA -> 1000 µl de R y 25 µl de muestra(suero).

- Seguidamente tapamos con parafina, mezclamos e incubamos 5" a 37ºC. - A continuación leemos la absorvancia del patrón y la muestra, frente a blanco de RT.Color estable como mínimo 30".

• RESULTADOS:

 Absorbancias: - Patrón= 0,548 nm. -Muestra= 0,419 nm. Cálculo: Abs. muestra/ Abs. patrón x 7(Conc. patrón)= mg /dL de glucosa en la muestra.
 0,419/0,584 x 7= 5,022 g/dL de proteínas totales.

• FOTOGRAFÍAS:

 REFRACTOMETRÍA:

Para la realización de esta práctica necesitaremos un refractómetro (aparato que se utiliza para medir la concentración de distintas disoluciones basandose en su índice de refracción).

• PROCEDIMIENTO:

- En primer lugar calibraremos el aparato con H20.
- Seguidamente limpiamos y añadimos una gota del suero a medir 
- Finalmente limpiamos .

• FOTOGRAFÍAS:

 RESULTADOS:

-Densidad suero= 6,1 g/dLde proteínas.