PRÁCTICA 4: CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA ASCENDENTE.

• OBJETIVOS:

Realizar una separación e identificación de los aminoácidos triptófano, alanina, valina y arginina presentes en una muestra.

• UTILIDAD CLÍNICA:

Hay enfermedades clínicas en las que se produce una alta [ ] de aminoácidos en el plasma y la orina. Este desequilibrio en la sangre se denomina aminoaciduria. Algunas de estas enfermedades son: fenilcetonuria, cistinuria o la enfermedad de Hartnup.

• FUNDAMENTOS:

Éste tipo de cromatografía consiste en la separación e identificación de sustancias químicas disueltas en un disolvente(fase móvil) que se mueve sobre una capa delgada  de un absorvente idóneo (fase estacionaria(gel de celulosa)).

• APARATAJE:

-Estufa.

• MATERIALES:

-Lámina de gel de celulosa(5 x 10 cm).
-Vaso de precipitado.
- Micropipeta(5 µl)
- Placa de Petri.
- Puntas de pipeta.

• REACTIVOS:

- Disolvente de cromatografía.
- Disolución reveladora de ninhidrina.
- Muestra problema de aminoácidos.
- Muestra patrón de aminoácidos(0,8 mg/mL de cada uno).

• PROCEDIMIENTO:

- En primer lugar cogemos la placa de gel de celulosa(con guantes y por los bordes) y marcamos los puntos donde se aplicarán las muestras(deben estar a 1,5 cm de la base y a 1 cm separados entre sí),con la placa en posición horizoltal, aplicar aprox 2 µl de la muestra y patrones de aminoácidos apoyando suavemente la punta de la micropipeta sobre el punto señalado en la celulosa.

- Una vez que las manchas se hayan secado al aire, intruducimos la placa verticalmente en el vaso de precipitado de forma que las muestras queden en la base de éste y cuidando que los puntos de aplicación queden por encima del nivel de disolvente, ponemos la placa de Petri encima del vaso de precipitado y dejamos que suba por capilaridad .

- Cuando el frente haya subido aproximadamente 8 cm, sacamos la placa de la cubeta y marcaremos con un lápiz el frente del solvente(hasta donde ha llegado la fase móvil) y secaremos la placa en la estufa.

- Con la placa seca y en posición vertical, pulverizamos con el revelador de ninhidrina; ésta debe hacerse de forma suave y uniforme(preferiblemente en campana extractora).

- Finalmente calentamos la placa 1' o 2' en estufa y se podrá observar las manchas de aminoácidos de color rosáceo distribuidas a lo largo del gel.

• RESULTADOS:

La Rf(relación al frente del solvente) de una sustancia en una fase móvil(disolvente) y estacionaria(gel) determinada va a ser constante. Ésta característica nos permite, mediante la comparación con patrones, la identificación de la sustancia en una mezcla.
Rf = distancia recorrida por el compuesto desde el origen(cm)/distancia recorrida por el eluyente desde el origen(cm)
Rf = 3 cm/ 5cm= 0´6 cm
Rf = 4,5 cm/5 cm=0,9 cm

Cada una de las manchas de la mezcla de aminoácidos obtenidas puede identificarse comparando su migración con las manchas de los patrones. El valor de la Rf de cada aminoácido es el mismo cuando está en una mezcla de aminoácidos que cuando está solo. Para los patrones de aminoácidos utilizados en estas condiciones los recorridos relativos teóricos son : Rf(Trip) = 0,89 Rf(Val) = 0,64 Rf(Ala) = 0,49 Rf(Arg) = 0,81

• FOTOGRAFÍAS: