PRÁCTICA 8: PRÁCTICA DE INMUNODIFUSIÓN RADIAL (MANCINI).

• OBETIVOS:

Cuantificar por inmunodifurión radial la [ ] de inmunoglobulinas en el suero sanguíneo bovino.

• FUNDAMENTOS:

El antisuero es el suero sanguíneo sanguíneo que contiene Ac contra el antígeno que se quiere medir. El Ag difunde a través del gel y se combina con el antisuero hasta alcanzar la zona de equivalencia. En este punto aparecen precipitados Ag-Ac en forma de císculo concéntrico alrededor del pocillo. El diámetro del cículo formado es proporcional a la  [ ] de Ag.

• APARATAJE:

- Contador de colonias.

• MATERIALES:

- Placas de petri(soporte del gel de agarosa).
- Micropipeta (10 µl).
- Punta de pipeta.
- Pipetas pateur.
- Cámara húmeda: placa de petri con un poco de algodón humedecido con agua destilada.
- Papel de filtro

• REACTIVOS:

- Disolución de lavado.
- Disolución colorante.
- Disolución decolorante.
- Patrones de IgG ( 0,05  0,1  0,2  0,4 mg/ml) y muestra problema (suero sanguíneo).

• PROCEDIMIENTO:

- En primer lugar aplicamos las muestras patrones y problemas de forma ordenada en los pocillos (10 µl).
- Seguidamente introducimos la placa de petri en la cámara húmeda y dejamos difundir a temperatura ambiente hasta que los precipitados puedan observarse a trasluz.
- A continuación retiramos la placa de la cámara húmeda y realizamos dos lavados cubriendo la placa entera con ayuda de una pipeta pasteur, recortamos varios papeles de filtro del mismo tamaño que el del gel y humedecemos con agua destilada el que queda en contacto directo con la agarosa, cerramos la placa y le colocamos peso encima durante 10' para que el gel quede reducido a una película húmeda de 1-2 mm que finalmente se terminará de secar en la estufa a 37º durante 10'.
- Una vez que el gel esté completamente seco y transparente la cubrimos con colorante ,una vez teñido, añadimos el decolorante (3-4') y agitamos suavemente.La disolución se debe cambiar unas 3-4 veces haste que el fondo de la placa haya quedado claro, finalmenye secamos en estufa.

• RESULTADOS:

Para calcular la [ ] de la muestra problema mediremos el diámetro de los aros con ayuda del contador de colonias y realizamos una curva de calibración como la que se muestra a continuación y a partir de la cual obtendremos dicha  [ ]

Diámetro muestra -> 5 mm
[ ] muestra -> 0,07 mg/ml

• FOTOGRAFÍAS:

 


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