PRÁCTICA 7: HEMOGLOBINA A1C.CROMATOGRÁFICA-ESPECTOFOTOMÉTRICA.

OBJETIVOS:

Concentración de HbA1C en una muestra.

FUNDAMENTOS:

Después de preparar un hemolizado, donde se elimina la fracción lábil, las hemoglobinas son retenidas por una resina de intercambio catiónico.. La hemoglobina HbA1C se eluye de forma específica, previa eliminación por lavado de la HbA1a+b, y se cuantifica por lectura fotométrica a 415 nm. La estimación de la [ ] relativa de HbA1C se realiza frente a la [ ]  de Hb total, determinada también por lectura fotométrica a 415 nm.

APARATAJE.

Fotómetro. Utilidad:
Instrumento utilizado para las medidas de absorción de REM(radiación electromagnética).

 MATERIALES:

- Tubos de ensayo.
- Gradilla.
- Micropipeta (50µl , 200µl y 400µl).
- Puntas de pipeta.
- Papel parafina.
- Gradilla de espectofotómetro.
- Cubetas de espectofotómetro.

REACTIVOS:

- R1
- R2
- R3
- Microcolumna.
- Sangre.

PROCEDIMIENTO:

-Primeramente preparamos el hemolizado añadiendo 50µl de sangre y 200µl de R1,tapamos con papel parafina, agitamos y dejamos a temperatura ambiente 10-15'.

-Seguidamente destapamos la microcolumna, rompemos la lengueta inferior y bajamos el disco superior hasta llegar al nivel de la resina con ayuda de una pipeta y dejamos gotear hasta que el líquido alcance el nivel del disco , desechandolo.

-A continuación aplicamos sobre el disco superior 50µl de hemolizado y desechamos el eluido.
Una vez que haya penetrado todo el hemolizado, añadimos 200µl de rectivo y volvemos a desechar el eluidoy para finalizar añadimos 2000µl de R2 y desechamos

-Por último, colocamos la microcolumna sobre otro tubo de ensayo y añadimos 400µl  de R3 y recogemos el eluido, tapamos con papel parafina y homogeneizamos.

-Por otro lado, pipeteamos en un tubo de ensayo 12,0ml de agua destilada y 50µl de hemolizado, tapamos con papel parafina y homogeneizamos.

-Traspasamos el contenido de ambos tubos a las cubetas de espectofotómetro donde leeremos la absorvancia a 415 nm frente a agua destilada.

RESULTADOS:

Absorbancias:
-Hb total= 0,585 nm.
-Hb A1C= 0,213 nm.
Cálculo:
A HbA1C/A Hb total x 100/3 = 12,24% HbA1C.

OBSERVACIONES:

Los resultados obtenidos no son correctos debido a las malas condiciones de la muestra(sangre).

FOTOGRAFÍAS: